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密理博超濾離心管的常見(jiàn)問(wèn)題與解答：

一：超濾離心管的膜材質(zhì)是什么？

密理博超濾離心管的膜材質(zhì)為默克密理博*的Ultracel再生纖維素膜，生產(chǎn)工藝嚴(yán)格，截留分子量明確而，蛋白吸附損失zui小。

二：如果要用超濾離心管的方法分離兩種蛋白，那么這兩個(gè)蛋白的大小需要相差多少？

按照經(jīng)驗(yàn)，建議兩個(gè)蛋白的分子量要相差一個(gè)數(shù)量級(jí)（10倍）

三：密理博超濾離心管可以用于病毒濃縮嗎？

可以。對(duì)于慢病毒推薦Amicon Ultra 100KDa；對(duì)于腺病毒推薦Amicon Ultra 50KDa。具體的操作步驟可以參考病毒濃縮純化試劑盒FTLV00003和 FTAV00003的產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)。

四：密理博超濾裝置是否可以用于高壓滅菌？

Amicon Ultra都是采用熱封設(shè)計(jì)，不可以用于高壓高溫滅菌。

五：超濾離心管可以用酒精消毒滅菌嗎？

Amicon Ultra與70%乙醇是兼容的中，但是對(duì)滅菌處理的具體方法沒(méi)有做相關(guān)的測(cè)試，所以無(wú)法提供更進(jìn)一步的參考信息。

六：超濾離心管含不含RNA酶？

不保證超濾離心管不包含RNA酶，建議用0.1%DEPC在37度浸泡2小時(shí)，以*滅活RNA酶；殘留的DEPC可以用Milli-Q超純水洗滌除去。

七：用超濾離心管去除去污劑是有什么需要注意的嗎？

去污劑因其*的性質(zhì)，當(dāng)濃度大于臨界微團(tuán)濃度（Critical Micelle Concentration、CMC）時(shí)，去污劑分子會(huì)聚集形成微團(tuán)而改變分子構(gòu)象，這有可能會(huì)影響去污劑的去除效果，具體的操作步驟請(qǐng)垂詢默克密理博。

八：蛋白在濃縮時(shí)出現(xiàn)了沉淀，如何改進(jìn)？

蛋白濃縮過(guò)快或者過(guò)度濃縮都有可能引起蛋白沉淀。建議蛋白濃縮后的zui終濃度不超過(guò)20mg/ml。對(duì)于對(duì)濃縮速度敏感而容易沉淀的蛋白，建議的方法是1）離心力降為推薦離心力的30%-50% 2）改用截留分子量更大的超濾管（如原本選用10K，此時(shí)可以選擇30K） 3）在濃縮過(guò)程中取出超濾管，用槍頭反復(fù)吹吸幾次后再繼續(xù)濃縮。

九：濃縮后發(fā)現(xiàn)濃縮液中沒(méi)有目的蛋白，可能的原因有哪些？

首先，Amicon Ultra超濾管的蛋白zui低起始濃度為25ug/ml。請(qǐng)確保樣本的起始濃度大于這個(gè)濃度。其次，如果問(wèn)題仍然出現(xiàn)，請(qǐng)不要丟棄樣本濾過(guò)液以便用于分析可能的原因：

1）如果目的樣本在過(guò)濾液中，那么請(qǐng)排查 ：a）是否選擇了合適截留分子量的超濾管（目的蛋白分子量的1/2或者1/3） b）使用的離心力是否在限定范圍內(nèi)？如果使用的是rpm，請(qǐng)換算成相應(yīng)的g離心力。c）離心機(jī)zui近是否有校準(zhǔn)過(guò)？d）是否嘗試這個(gè)蛋白？如果能確保用同樣的超濾管對(duì)其它蛋白成功操作的話，那么有可能是這個(gè)目的蛋白的原因。有時(shí)蛋白會(huì)因其本身的一些特性（構(gòu)象差異）而影響濃縮效果，建議選用上一分子量級(jí)別的超濾管（如原本選用30K，此時(shí)可以選擇10K）。

2）如果目的樣本也不在濾過(guò)液中，那么：a）蛋白樣本起始濃度是否大于25ug/ml？b）用來(lái)確定樣本濃度的方法是什么？是否可信？ c）目的蛋白是不是沉淀了？如果是，具體解決方法請(qǐng)參考上面的關(guān)于蛋白沉淀問(wèn)題的解釋。

十：有時(shí)候用超濾離心管連水都離不下來(lái)，可能是什么原因？

超濾離心管超濾膜中含有微量甘油。如果出現(xiàn)這種情況，請(qǐng)先用0.1N NaOH清洗再離心。zui后用緩沖液或Milli-Q水再次清洗后甩干。清洗后的濾膜應(yīng)立即使用，如暫時(shí)不用，請(qǐng)保持潤(rùn)濕狀態(tài)，避免重新干燥。

十一：說(shuō)明書(shū)推薦在室溫下進(jìn)行離心，考慮到蛋白的穩(wěn)定性，是否可以在4 攝氏度進(jìn)行離心?

可以,但是低溫會(huì)增加蛋白樣品的粘性,導(dǎo)致流速減慢,建議可將離心時(shí)間延長(zhǎng)到原來(lái)的1.5倍。

十二：如何對(duì)超濾離心管進(jìn)行去除內(nèi)毒素的處理？

提供的超濾離心管是沒(méi)有經(jīng)過(guò)去內(nèi)毒素處理的，同時(shí)由于內(nèi)毒素通常以多聚體的形式存在，大小在10-1000KD之間不等，在超濾的過(guò)程中是無(wú)法去除的?？梢詫?shí)驗(yàn)前通過(guò)先用0.5M NaOH預(yù)清洗，隨后用Milli-Q水/緩沖液清洗的步驟去除大部分內(nèi)毒素。關(guān)于針對(duì)Amicon Microcon Centricon嘗試過(guò)的內(nèi)毒素去除方案，請(qǐng)垂詢默克密理博技術(shù)。

十三：用濃縮后的蛋白做下游分析時(shí)發(fā)現(xiàn)有干擾，可能有哪些原因？

密理博超濾膜含有微量甘油。如果此成分干擾分析，可用緩沖液或Milli-Q水預(yù)清洗。如果干擾仍存在，用0.1N NaOH清洗，然后用緩沖液或Milli-Q水再次清洗后甩干。

十四：懷疑濃縮過(guò)程中目的蛋白和超濾膜之間可能存在非特異性吸附，如何改善？

密理博超濾離心管使用的是再生纖維素膜，這種材質(zhì)是蛋白吸附zui低的超濾膜。但是對(duì)于一些疏水性蛋白或非極性蛋白，它們和膜的非特異吸附可能會(huì)增強(qiáng)，對(duì)于這種情況，可以嘗試在實(shí)驗(yàn)前對(duì)超濾管進(jìn)行封閉處理，也可以嘗試換成Amicon Ultra0.5或2來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)減小膜面積來(lái)降低非特異性吸附。