超濾離心管使用方法和注意事項(xiàng)
超濾離心管使用方法和注意事項(xiàng)
蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）。也有其它型號(hào)的、不同體積大小和MWCO超濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標(biāo)體積而定?？芍貜?fù)使用。
1、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。
2、新買(mǎi)來(lái)的超濾是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量*過(guò)膜，冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘。然后將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過(guò)管頂?shù)陌拙€(xiàn)為準(zhǔn)。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預(yù)冷。
3、平衡。質(zhì)量和重心二者都要達(dá)到平衡。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開(kāi)始離心超濾（離心機(jī)預(yù)冷至4度）。膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說(shuō)明書(shū)調(diào)整（角轉(zhuǎn)離心機(jī)的情況是膜與軸垂直）。在實(shí)際使用中，一般轉(zhuǎn)速開(kāi)的比說(shuō)明書(shū)里的要低，這樣可以延長(zhǎng)離心管的使用壽命。
4、當(dāng)濃縮到剩下1ml時(shí)，【取50ul國(guó)產(chǎn)Bradford溶液，加入10ul流穿，看有沒(méi)變藍(lán)色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開(kāi)始超濾。要判斷是否漏管，用5mg/ml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測(cè)】，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作，防止蛋白受熱），直到所有濃縮液都加完為止。離心過(guò)程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀，導(dǎo)致堵管。若發(fā)生沉淀，要確定沉淀的具體原因，是蛋白濃度過(guò)高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時(shí)超濾，降低濃度的辦法解決，后者的方法是換不同的Buffer，直到蛋白不發(fā)生沉淀為止。
5、前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時(shí)候，輕輕加入新的Buffer（經(jīng)0.22um超濾膜超濾），再濃縮至1ml左右，連續(xù)三次，zui后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定，一般不多于500ul，也有濃縮至200ul以?xún)?nèi)的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達(dá)到1000倍以上，基本上可以達(dá)到換buffer的目的。
6、取出zui終蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用黃槍頭（200ul）取，輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜，然后吸取濃縮液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的zui后一點(diǎn)濃縮液不必吸取，否則難度太大，有可能損壞超濾膜。zui后加入MilliQ水到超濾管中，沒(méi)過(guò)超濾膜，防止膜失水變干。
