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動物腫瘤（臟器）組織巨噬細(xì)胞分離液實驗方法

技術(shù)文檔編號：TBD0052SOP

【產(chǎn)品規(guī)格】

2×200ml/Kit

【產(chǎn)品組成】

為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：

 【實驗前準(zhǔn)備】

 適用儀器：zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)

 【檢驗方法】

 全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。

 1. 首先制備組織單細(xì)胞懸液，制備方法詳見“組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)（文檔編號：  TBD0004SOP）”。

2. 取一支離心管，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:1，試劑總量與細(xì)胞懸液體積比為 2：1。如細(xì)胞懸液為 2ml，則先后加入分離1：3ml、分離液 2：1ml。試劑總量zui少不低于 4ml。），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。

3. 用吸管小心吸取細(xì)胞懸液加于分離液液面上，500g，離心 25min（注：根據(jù)樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到分離效果）。

4. 離心后，此時離心管中由上至下分為六層。*層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色巨噬細(xì)胞層（*層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層為環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層（下層50%分離液 2 及第二層白環(huán)）。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì)胞層。第六層為紅細(xì)胞層。

5. 用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細(xì)胞。

6. 250g，離心 10min。

7. 棄上清。

8. 用吸管以 5-10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

9. 250g，離心 10min。

10. 重復(fù) 7、8、9，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

分離圖例：

 【差異貼壁法純化細(xì)胞】

 （1）用巨噬細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號：TBD20180029）或巨噬細(xì)胞*培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號：         TBD20180059）以 1.5-3×10⁶ 個/ml 的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板或細(xì)胞瓶         中，放于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。

 （2）2-4 小時內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱為單核細(xì)胞）。

 （3）10-24 小時內(nèi)貼壁的單個核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。

 （4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞。

 注：

   a) 無血清培養(yǎng)基中不含任何動物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8%經(jīng)灝洋      篩選的胎牛血清。

   b) *培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）。

   c) 由于每種細(xì)胞的貼壁時間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡單的純化目的，此法成本相對較      低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰性分選。

 【注意事項】

1. 全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得*的實驗結(jié)果，在取    樣 2h 內(nèi)進(jìn)行實驗，樣品存放時間越長，細(xì)胞分離效果越差。樣品放置超過 6h 后分離效果更差    甚至不能達(dá)到分離目的。

2. 本實驗不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)    堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細(xì)胞    分離效果。

3. 吸取過多的乳白色細(xì)胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)      量增加。

 4. 分離液用量大于組織單細(xì)胞懸液樣本時，分離效果更佳。

 【儲存條件及有效期】

   常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟封后置常溫保    存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。

 【參考值（參考范圍）】

 本實驗巨噬細(xì)胞提取率大于 80%。

   下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。

【相關(guān)實驗技術(shù)方案】

1. 組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)。

2. 所獲得巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。

3. 所獲得巨噬細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。

4. 所獲得巨噬細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)

B.免疫組化技術(shù)

C.原位雜交技術(shù)

D.PCR 技術(shù)

【可能存在的問題及解決方法】

 1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：

2. 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根    據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對離心條件進(jìn)行調(diào)整時，恒定離心時間，對離心轉(zhuǎn)速進(jìn)    行調(diào)整。

3. 本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級原料，性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細(xì)    胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。

   注：在對離心條件進(jìn)行調(diào)整時，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到分離效果，

   離心力不得小于 400g，不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準(zhǔn)。